（1） 退火溫度不合適。以2℃為梯度設(shè)計梯度PCR反應(yīng)優(yōu)化退火溫度。

（2） DNA模板量太少。增加DNA模板量。

（3） PCR循環(huán)數(shù)不足。增加反應(yīng)循環(huán)數(shù)。

（4） 引物量不足。增加體系中引物含量。

（5） 延伸時間太短。以1kb/分鐘的原則設(shè)置延伸時間。

（6） 變性時間過長。變性時間過長會導(dǎo)致DNA聚合酶失活。

（7） DNA模板中存在抑制劑。確保DNA模板干凈